Главная >> Медицинские статьи >> Лабораторная диагностика

Место качественной модификации метода ПЦР в первичной диагностике ИППП и контроле эффективности лечения

Ивашков Е.А.
В немалой степени успеху полимеразной цепной реакции (ПЦР) способствовало появление на медицинском рынке высокотехнологичных коммерческих тест-систем, значительно упростивших и ускоривших проведение реакции. В то же время применение нового метода поставило и ряд вопросов, один из которых - интерпретация результатов ПЦР.
Высокая чувствительность метода имеет и оборотную сторону - выявляемые десятки и сотни копий микроорганизмов в пробе не всегда "достаточны" для возникновения заболевания. Положительные результаты ПЦР в отсутствие клинических признаков заболевания (нередко сопровождаемые отрицательными результатами других лабораторных исследований) позволило "предъявить обвинения" этому методу в гипердиагностике. Открытым остаётся вопрос о трактовке результатов контрольных исследований методом ПЦР: качественный метод не позволяет достоверно оценить динамику популяции возбудителя под влиянием проводимого лечения.

Тест-системы, создаваемые для количественного определения патогенов методом ПЦР, либо обладают меньшей чувствительностью по сравнению с "качественными" (большинство наборов с внутренним контролем), либо требуют значительно больших затрат расходных материалов (метод последовательного разведения). Кроме того, в условиях использования реального клинического материала нередко наблюдаются парадоксальные ситуации, когда образцы с большим содержанием определяемой ДНК дают более слабое свечение, чем пробы, бедные "мишенями", и наоборот.

Целью данной работы была оценка эффективности качественного определения возбудителей инфекций, передающихся половым путём (ИППП) на основании сопоставления частоты их обнаружения до проведения лечения и по окончании терапии.

Материалы и методы.

Материал (моча, соскобы из цервикального канала, уретры, эпителий из заднего свода влагалища, аспираты из полости матки) получали от женщин, обращавшихся за помощью к врачам-гинекологам женских консультаций г. Хабаровска. Всего было обследовано 2112 человек, 1747 из них - при первичном посещении врача и 365 - после проведения лечения. Количество анализов составило соответственно 6728, 6179 и 549. Контрольное исследование осуществляли не ранее, чем через 14 дней (для хламидий - не ранее одного месяца) после окончания терапии. Для проведения ПЦР использовались российские диагностические тест-системы ("горячий старт") по технологии, рекомендованной производителем наборов. Результаты детекции документировались фотографированием геля на фотоплёнку "Микрат-300". За счёт высокого коэффициента контрастности (? = 4,0) и длительной экспозиции фиксировались полосы амплификата, недоступные для визуального различения. Данные хранились и обрабатывались в СУБД MS Access 97.

Результаты и обсуждение.

Проведённое исследование показало, что Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis присутствовали соответственно в 20,5 и 31,8% исследованных образцов (см. Таблицу 1). Частота выявления этих микроорганизмов существенно не отличалась во время первого посещения врача и при контрольном исследовании после лечения. Кажущийся парадокс легко объясним: терапия была назначена тем женщинам, у которых был обнаружен возбудитель заболевания, иначе говоря, - инфицированность в этой группе первоначально составляла 100% а после проведения лечения снизилась для микоплазм втрое и впятеро для хламидий.

M.genitalium в пробах, взятых до начала терапии, встречалась в 9,3% (в контроле после лечения - 6,4%), U.urealiticum - 62,8% (53%). Персистенция цитомегаловируса в цервикальном канале установлена в 21,1% (проводимое лечение снизило этот процент до 13,3), вирус простого герпеса обнаружен в 18,3% (9,1%).

Приведённые результаты с определёнными оговорками позволяют оценить устойчивость различных групп микроорганизмов к терапии (в частности, учитывая того, что большой объём выборки по различным медицинским учреждениям нивелировал особенности схем лечения). Так, практически при одинаковой частоте обнаружения трихомонад и кандид до начала терапии (около 23%), первые впоследствии идентифицированы только у 14,3%, а вторые выявлены у 40% лечившихся женщин. Полученные данные хорошо вписываются в наблюдаемую нами в последнее время картину: трихомониаз и гонорея, в отличие от других ЗППП, стали встречаться реже (это же показывает и Российская статистика). В то же время, рецидивирующие кандидозы и бактериальные вагинозы (БВ) стали настолько обычным явлением (например, последние мы диагносцируем у 26% женщин), что некоторые врачи стали считать их вариантом нормы. Что же показывает проведённое исследование? Gardnerella vaginalis не только чаще других обнаруживает себя в генитальном тракте женщин, но и делит пальму первенства по устойчивости к проводимой терапии (50%) с U.urealiticum (53%) - вторым, едва ли не облигатным компонентом биоценоза влагалища при БВ. О третьем компоненте - Mycoplasma hominis- было сказано выше.

Понимая безусловную неприемлемость полуколичественной оценки ПЦР в каждом отдельно взятом исследовании, мы предприняли попытку использовать данный метод для сравнительной оценки относительно больших групп (женщин до начала лечения и после его завершения). В этом случае девиации, связанные с наличием ингибиторов термостабильной полимеразы и т.п. взаимно гасятся в обеих исследуемых группах, поскольку начинают "работать" законы статистики для больших популяций.

Интенсивность свечения полосы продукта амплификации сопоставляли с люминисценцией амплифицированного фрагмента соответствующей контрольной ДНК (4 балла, или 4+). Невидимой глазом, фиксированной только на фотоплёнке светящейся полосе амплификата соответствовал 1+. Остальные градации занимали промежуточное положение.

Результаты такого "полуколичественного" исследования приведены в Таблице. Наиболее интересным нам представляется оценка интенсивности реакции в группе хламидий. Если при первичном исследовании полосы продукта амплификации светились довольно ярко (во все "балльные" интервалы попало приблизительно одинаковое число проб), то в контрольном тесте явно преобладали крайне слабые (невидимые глазом, но совершенно чётко зафиксированные на фотоплёнке) сигналы. "Видимые" полосы составили в контроле менее трети от всех обнаруженных!

Как указывалось, контрольное исследование на хламидии проводили через месяц и более после завершения терапии, когда происходило полное замещение клеток призматического эпителия и элиминация находящихся в них погибших ретикулярных и элементарных частиц хламидий. Проводимые контрольные исследования не показали наличия полос в "отрицательных контролях". Поэтому приведённые выше результаты не могут быть следствием технологических погрешностей.

По-видимому, приведённые факты должны побудить сделать соответствующие выводы исследователей, игнорирующих применение фотографических или электронных (чувствительная видеокамера? компьютер) технологий фиксации результатов амплификации.

При трактовке результатов ПЦР врач должен учитывать современное состояние вопроса: хламидийная инфекция коварна. Этот вид микроорганизмов представляет собой реальную угрозу для женщины и ребёнка даже в минимальных количествах, выявляемых молекулярно-биологическими методами.

Не существует чётких критериев степени опасности присутствия разного количества CMV и HSV в цервикальном канале, но достоверно известно, что сам факт их персистенции определяет значительно более высокий процент инфицирования ребёнка в родах даже у серопозитивных, обладающих определённым иммунитетом, женщин. При первичном инфицировании частота и тяжесть вирусных поражений многократно возрастают.

Несколько сложнее трактовка выявления микоплазм. Известно, что, например, уреаплазмы могут длительное время персистировать в урогенитальном тракте, не вызывая видимых патологических изменений. Высокий процент обнаружения данного вида микроорганизмов в наших исследованиях также косвенно свидетельствует об отсутствии 100% патогенности. Учитывая побочные действия антибиотиков, при отсутствии клинических проявлений обнаружение уреаплазм не должно служить показанием к антибиотикотерапии (исключение - планируемая беременность - см. ниже), может быть рекомендована коррекция иммунитета. Тем не менее, при воспалительном процессе выявление уреаплазм в отсутствии других патогенов позволяет считать их этиологическим фактором заболевания. Не располагают к благодушию и приведённые выше результаты: U.urealiticum неожиданно оказалась микроорганизмом, максимально устойчивым к проводимой терапии. Многие исследователи указывают на взаимосвязь присутствия уреаплазм в цервикальном канале беременных с преждевременным разрывом амниотической оболочки и излитием околоплодных вод; профилактическая антибиотикотерапия уменьшала как частоту выявления уреаплазм, так и риск преждевременных родов.

Таким образом, при выявлении потенциально патогенных бактерий и вирусов не следует забывать о том, что болезнь есть взаимодействие микро- и макроорганизма. Во многих случаях количественные критерии оказываются неприменимыми: инфекционный процесс может быть гораздо более опасным в присутствии относительного небольшого количества высокопатогенных возбудителей, при активном синергизме патогенов, при временном ослаблении иммунной системы.

Всё это позволяет считать, что даже количественная модификация метода ПЦР может и должна применяться при установлении этиологических факторов заболеваний урогенитальной сферы.

Метод высоко информативен не только при первичной диагностике инфицирования урогенитального тракта, но и при контроле излеченности от ИППП. В сочетании с другими методами диагностики он даёт думающему врачу полную информацию для принятия правильного решения.


* Ивашков Е.А. Место качественной модификации метода ПЦР в первичной диагностике ИППП и контроле эффективности лечения . Сб. тез. докл. 3-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине, Москва, 25-27 января 2000 г. ". М., 2000. с. 102-106.
Статья опубликована на сайтеhttp://www.rusmg.ru 

21.03.2004


Смотрите также:
Как самой распознать беременность?,   Измените меня по-быстрому!,   Лечение гипертонической болезни доброкачественного течения,   Советы доктора Шелтона,   Решение проблем игровой зависимости
Интересные факты:
Об отрицательном влиянии некоторых лекарственных средств на цикл развития волосяных фолликулов и рост волос
Валерия Мордовцева ЦКВИ МЗ РФ, Москва В основе нарушения роста волос (их поредения различной степени выраженности), а также (реже) развития гипертрихоза лежат многочисленные эндогенные и экзогенные факторы. Среди последних немалую роль играет применение различных медикаментозных средств. При этом выпадение волос может наблюдаться не сразу, а через несколько недель или месяцев после н
Надежда есть
Средняя продолжительность жизни наркомана – 4-5 лет. Каждый год потребления наркотиков отнимает 20-25% жизни. Каждый наркоман тратит в год на наркотики в среднем $12 000 – 18 000. Это статистика.
Острые и хронические боли в области позвоночника
К.м.н. Ю.А. Олюнин ГУ Институт ревматологии РАМН, Москва Боли в области позвоночника относятся к числу наиболее распространенных клинических нарушений. Изменения, способные вызывать болевой синдром, весьма разнообразны. В большинстве случаев точно идентифицировать механизм его возникновения не представляется возможным. Такую клиническую симптоматику в России принято классифиц
Спастичность – современные подходы к терапии
П.Р. Камчатнов Расстройства мышечного тонуса являются одним из наиболее часто встречающихся неврологических синдромов, при этом повышение тонуса по спастическому типу (спастичность) имеет исключительно широкую распространенность. Спастичность не является синдромом, специфичным для какого–либо заболевания и отмечается при самых различных органических поражениях головного и спинного мозга
Холестерин
Холестерин - жироподобное вещество из группы стеринов животного происхождения. Вряд ли можно утверждать, что повышение уровня холестерина в крови непременно приводит к заболеванию атеросклерозом, хотя и является фактором риска eго возникновения. Более того, наряду с отрицательной известны положительные стороны физиологической роли холестерина: он входит в состав тканей и клеток, регулирует прониц

 


© 2005-2017 www.medband.ru, написать письмо
Место качественной модификации метода ПЦР в первичной диагностике ИППП и контроле эффективности лечения
Медицина от А до Я. Заболевания. Симптомы.
Rambler's Top100